<< на главную
<< назад

ПЦР в реальном времени с вырожденными праймерами и зондом для идентификации "чужеродных" генов

Матвеева* Т.В., Лутова** Л.А, Богомаз** Д.И.
*Биологический Научно-исследовательский институт Санкт-Петербургского государственного университета
** Санкт-Петербургский государственный университет,

Проблема получения трансгенных растений в лабораторных условиях напрямую связана с проблемой изучения горизонтального переноса генов от прокариот к эукариотам в природе. Способность почвенных бактерий Agrobacterium tumefaciens и Agrobacterium rhizogenes переносить свои гены в растения в лабораторных условиях, а также возможность регенерации из трансгенных тканей целых растений (даже при трансформации штаммами дикого типа) наводят на мысль о существовании подобных процессов в природе. Доказательством тому служат многочисленные примеры существования последовательностей, гомологичных онкогенам Agrobacterium rhizogenes в геномах растений рода Nicotiana. Поиск новых примеров горизонтального переноса генов является актуальной задачей, поскольку обнаружение онкогенов в сельскохозяйственных культурах, используемых тысячелетиями, позволит уменьшить негативные настроения в обществе связанные с потреблением трансгенных растений, а обнаружение таковых в диких видах растений поможет развеять сомнения относительно их биобезопасности. До последнего времени для решения подобной задачи использовали методы блот-гибридизации геномной ДНК по Саузерну, с последующим клонированием и секвенированием фрагментов, давших позитивный гибридизационный сигнал, а также классические варианты ПЦР с последующей гибридизацией по Саузерну наработанных продуктов и секвенированием фрагментов, давших позитивный гибридизационный сигнал. Развитие и широкое распространение в последние годы метода ПЦР в реальном времени позволило применить его для решения данной задачи. Для этой цели используется модификация метода, называемая "TaqMan", которая позволяет совмещать в одной реакции преимущества ПЦР и гибридизации по Саузерну. Использование вырожденных праймеров и зонда, сконструированных к консервативным частям гена интереса, позволяет надеяться на обнаружение онкогенов, последовательности которых несколько отличаются от описанных ранее. Для окончательного доказательства гомологии обнаруженной последовательности уже известным онкогенам необходимо секвенирования продукта ПЦР. Быстрота метода позволяет анализировать большое количество образцов за короткое время так, что стадией, лимитирующей скорость анализа, является выделение ДНК. Еще одним преимуществом метода является возможность контролируемого проведения нескольких реакций в одной реакционной смеси. Так, используемый нами прибор, произведенный в Институте аналитического приборостроения РАН, при использовании праймеров и зондов, синтезированных ЗАО "Синтол" позволяет проводить до 4х реакций одновременно.

Исследование осуществлено при финансовой поддержке CRDF совместно с Министерством Образования РФ, грант ST-012-0.

<< на главную
<< назад