<< cодержание

ПРОФИЛАКТИКА И ТЕРАПИЯ СИБИРЕЯЗВЕННОЙ ИНФЕКЦИИ

Попов В.Г., Щербаков Г.Я., Маринин Л.И., Старицын Н.А., Степанов А.В.

ГНЦ прикладной микробиологии Минздрава России

Цель работы: обобщить данные литературы о состоянии вопроса профилактики и лечения сибиреязвенной инфекции, определить перспективы дальнейших исследований.

Современная эпидемиологическая обстановка по сибирской язве рассматривается отечественными и зарубежными ученными как напряженная и не имеющая тенденции к стабилизации /1, 2/. Это объясняется целым рядом причин. Во-первых, сибиреязвенные споры широко распространены в природе, обладают высокой устойчивостью к неблагоприятным факторам внешней среды. Во-вторых, применение B.anthracis в качестве средств биотерроризма констатируется как очевидный факт /3/. В-третьих, культурально-морфологическая изменчивость B.anthracis затрудняет идентификацию и, соответственно, своевременно и адекватно реагировать на складывающуюся эпидобстановку. Наконец, ошибочные взгляды на врачебную тактику при решении вопросов экстренной профилактики и лечения заболевания, вызванного антибиотикоустойчивыми штаммами, отсутствие необходимых средств лечения, низкий уровень профессиональной подготовки врачебного персонала к работе с особо опасными инфекциями не всегда позволяет достичь желаемого результата. Применение для профилактики данной инфекции различных вакцин повышает эффективность противоэпидемических мероприятий, но не является абсолютной гарантией от летальных исходов / 4, 5 /.

Исходя из выше изложенного, поиск новых средств профилактики и лечения сибирской язвы, разработка новых подходов в этом направлении являются актуальными. В настоящее время в основу лечения всех форм сибирской язвы положен принцип применения антибиотиков в сочетании с гетерологичным специфическим глобулином /6/. Больным с легким течением заболевания назначают антибиотики пенициллинового и тетрациклинового ряда в течение 5-7 дней. При средне тяжелом и тяжелом течении сибирской язвы лечение антибиотиками должно сочетаться с введением патогенетических средств и специфического глобулина. В этом случае пенициллин вводят как внутривенно, так и внутримышечно, кроме того, применяют тетрациклиновые препараты.

Глобулин вводят лишь при отсутствии у больного повышенной чувствительности к нему. Очень тяжелое течение сибирской язвы и сепсис требуют интенсивной комплексной терапии. Гамма глобулин вводят без определения чувствительности больного к нему на фоне преднизалона /6/.

В литературе имеются сведения о лечении разновидностей висцеральных форм сибирской язвы (кишечной, легочной), сибиреязвенного менингита хлорамфениколом, гентамицином, кристапеном и другими антибиотиками резерва /7/. Однако при позднем введении, на стадии выраженной токсемии, они не всегда оказывали лечебное действие. Инфекция протекает чрезвычайно остро и скоротечно.

Одним из возможных направлений поиска альтернативных средств в лечении и профилактике сибиреязвенной инфекции может быть использование специфических препаратов бактериофагов и иммуноглобулинов для внутривенного введения.

Применение фагов в лечебных целях при ряде инфекционных заболеваний практикуется более ста лет /8, 9/. Однако, по фаготерапии B. anthracis опубликовано лишь несколько работ, в период с 1922 по 1933 годы. Интерес к этому направлению значительно снизился с появлением антибиотиков.

Кроме того, положительный лечебный эффект при фаготерапии B.anlhracis наблюдался не всегда. Одна из причин первых неудач - недостаточная изученность природы бактериальных вирусов. Другая - случайный, эмпирический выбор фагов для лечебных целей. Следует также отметить, что многие исследователи не учитывали методические нюансы культивирования фагов и особенности способов их хранения.

Исследование биологических и биохимических свойств фагов, в частности молекулярных аспектов рецепторной специфичности, может обеспечить новое направление в области фаготерапии. В данном случае речь идет о разработке фаговых препаратов, включающих фаги с разной рецепторной специфичностью, а также отдельные элементы фагов, отвечающих за ингибирование молекулярных механизмов клеточных функций. Использование в этом случае фагов (клетка полностью перестает функционировать) более эффективно по сравнению с другими антимикробными агентами. Наглядным примером использования такого подхода стало недавнее открытие, показавшее, что рекомбинантный белок лизин, полученный из гамма фага B.anlhracis, можно использовать для специфического ингибирования прорастания и спорообразования. Появление возросшего числа секвенированных геномов бактериофагов и биоинформатики, позволяет прогнозировать с некоторой степенью достоверности функции некоторых генов бактериофагов.

Не менее важным, чем антибиотикотерапия, может быть применение химически чистых препаратов специфических антител. В настоящие время достаточно широко используются так называемые препараты направленного действия: противогриппозный, антистафилококковый, противостолбнячный, против клещевого энцефалита, противодифтерийный и другие глобулины /10/.За рубежом сформировалось целое направление по применению, дозировке, способам использования иммуноглобулинов для внутривенного введения /11/. Однако внутривенное введение гетерогенного сибиреязвенного глобулина невозможно из-за возникновения анафилактической реакции.

При лечении ряда заболеваний бактериальной этиологии применяют препарат, состоящий из F(ab)2 - F(ab) - фрагментов иммуноглобулина G. Он эффективней JgG, так как в меньшей степени подавляет иммунную систему, обладая, в тоже время, полноценной способностью связываться с бактериальными антигенами. Побочные реакции на его введение полностью отсутствуют, а биологическая активность выше /12/. Проведенные нами исследования подтверждают эти данные на примере сибиреязвенной инфекции.

В серии опытов по оценке биологических свойств иммуноглобулинов различных классов показано, что в JgG фракции сыворотки иммунных лабораторных животных содержатся антитела к протективному антигену В. anthracis /13/. Антитела именно этого класса ингибируют развитие спор и капсулообразование, а так же лизируют вегетативные клетки (табл. 1, 2). JgM активирует фагоцитоз прорастающих спор, опсонизирующий эффект JgM в отношении вегетативных и инкапсулированных бацилл не отмечается (табл. 3, 4, 5,) / 14 /.

При исследовании биологической активности антител in vivo на кроликах установлено, что внутривенное введение гомологичных препаратов JgG, F(ab)2 - фрагментов в 10% концентрации за 1 час до инфицирования животных, а также в ранние сроки после инфицирования (1, 4, 8, 12, 16, 20, 24 часа) оказывает выраженный защитный эффект.

Таблица 1. Ингибирующее влияние иммунной сыворотки и противосибиреязвенных антител на прорастание спор B.anthracis

Показатель,
%

Контроль Иммунная сыворотка Гамма глобулин Иммуноглобулины неиммунных кроликов Иммуноглобулины иммунных кроликов
    прогретая непрогретая   JgG JgA JgM JgG JgA JgA
J 46±1 56±4 60±4 59±4 45±1 46±2 45±2 60±1 45±2 49±5
N 68±3 49±3 43±3 44±3 70±3 68±6 60±6 43±2 70±6 62±1
SJ - 28 37 35 <1 1 <1 37 <1 9

Примечание:
1. J - степень инициации спор;
2. N- количество проросших спор;
3. SJ- степень ингибирования, рассчитанная по формуле SJ= 100 -Nопыт / N kонтроль х 100%;
4. В данной таблице приведены средние значения (M ± m) данных 3-5 опытов, каждый опыт выполнен в 3 повторностях.
5. Исходная концентрация иммуноглобулинов, гамма - глобулина (рассчитанная по содержанию белка) равна их содержанию в сыворотке, концентрация препаратов в питательной среде составляла 10%.

Таблица 2. Сравнительная оценка ингибирующего действия антител на капсулообразование B. Anthracis

Исследуемый препарат
Концентрация препарата, мг/мл Содержание капсульного вещества, мкг/мг сухого остатка клеток Ингибирующая активность,
ед/мг белка
    Общее Глутамилполипептидная фракция по капсульному веществу по глутамил-полипептидной фракции
Сыворотка 156,0 63,1±5,8 41,7±6,7 0,2 0,3
Гамма глобулин 10,0 45,4±4,7 26,73,9 5,9 6,5
Jg G 6,3 28,6±3,1 21,2±1,7 11,8 11,5
контроль 156,0 110,0±7,0 75,6±10,1 0 0

Таблица 3. Результаты опсонофагоцитарной реакции в отношении проросших спор

Опсонизирующий фактор Показатели фагоцитоза
  В иммунной системе В неиммунной системе
  Фагоцитарное число,%
Фагоцитарный индекс
ОД,% Фагоцитарное число,% Фагоцитарный индекс ОД,%
сыворотка 89±3,2
<0,05
7,81±0,31
<0,05
37 <0,05 78,2±1,2
<0,05
4,81±0,2
>0,05
4
<0,05
JgG 62,2±8,1
>0,05
6,52±0,51
>0,05
1
>0,05
71,8±2.1
>0,05
4,80±0,32
>0,05
0
>0,05
JgA 63,9±11,2
>0,05
7,51±1.20
>0,05
8
>0,05
71,9±1,3
>0,05
5,01±0,19
>0,05
0
>0,05
JgM 94,3±4,1
<0,05
8,58±0,31
<0,05
45 <0,05 70,9±2,3
>0,05
5,41±0,32
>0,05
5
>0,05
контроль 78,8±2,5 <0,05 5.60±0,28
>0,05
0 69,9±2,1 5,21±0,44 0

Примечание:
1. ОД опсонизирующее действие среды, рассчитанное по формуле ОД=100-Фк\Фо х 100%, где Фк - активность фагоцитоза в контроле, Фо - активность фагоцитоза в опыте.
2. Исходная концентрация иммуноглобулинов, рассчитанная по содержанию белка, равна их содержанию в сыворотке, концентрация препаратов в питательной среде составляла 10%.

Таблица 4. Результаты опсонофагоцитарной реакции в отношении вегетативных клеток

Опсонизирующий фактор

Показатели фагоцитоза
  В иммунной системе В не иммунной системе
  Фагоцитарное число,% Фагоцитарный индекс Фагоцитарное число,% Фагоцитарный индекс
сыворотка 29,4±5,1 3,08±0,14 31,2±4.1 3,12±0,31
JgG 18,2±8,1 3,05±0,18 26,2±7,2 3,08±0,18
JgA 16,3±9,2 3,25±0,11 19,3±4,1 3,21±0,43
JgM 19,3±8,1 3,19±0,22 22,1±6,4 3,11±0,21
контроль 29,2±7,4 3,07±0,41 21,1±4.8 3.32±0.41

Таблица 5. Фагоцитоз нормальных макрофагами проросших спор, сенсибилизированных сывороткой или иммуноглобулинами иммунных кроликов

Опсонизирующий фактор Показатели фагоцитоза
  Фагоцитарное
число, %
Фагоцитарный
Индекс
ОД, %
сыворотка 91,2±4,1
<0,05
7,62±0,32
<0,05
49
<0,05
JgG 69,3±3,2
>0,05
4,21±0,38
>0,05
0
>0,05
JgA 71,1±2,8
>0,05
4,82±0,
>0,05
0
>0,05
JgM 96,6±3,1
<0,05
8,20±0,31
<0,05
55
<0,05
контроль 67,1±4,2 5.60±0,28
>0,05
0

Приведенные данные свидетельствуют о неоднозначной биологической роли отдельных классов иммуноглобулинов в системе специфического иммунитета при сибирской язве, и могут быть использованы в дальнейшем при разработке сывороточных препаратов для экстренной профилактики и терапии.

Подходы к созданию подобных препаратов различные. Это может быть получение специфических антител из сыворотки (плазмы) крови иммунизированных людей. Данное направление связано со сложностью получения исходного сырья с высокими титрами специфических антител.

Второе направление работ - получение моноклональных антител с заданной специфичностью к отдельным антигенам В. anthracis на различных стадиях развития с помощью современной биотехнологии, является, на наш взгляд, более перспективным /15, 16/.

Резкое увеличение числа лабораторий за рубежом, производящих моноклональные антитела с помощью гибридомной технологии, является свидетельством преимущества использования моноклональных по сравнению со стандартными препаратами антител человека. В качестве примера можно привести работы по получению клеточных линий и их клонов, которые вырабатывают антитела человека к столбнячному анатоксину и токсину /16/. Подобный результат может иметь научное и практическое значение для получения противосибиреязвенных антител.

Анализ, данных литературы и результаты собственных исследований позволяют сделать следующее заключение. Для профилактики и лечения сибиреязвенной инфекции используют живые, химические, комбинированные вакцины, антибиотики и гамма глобулин. Однако появление антибиотикорезисентных штаммов В. anihrticia и реальная угроза их применения в качестве потенциальных агентов биотерроризма могут привести к тяжелым последствиям. Коммерческий противосибиреязвенный гамма глобулин, как и другие гетерологичные сывороточные препараты обладают сенсибилизирующими свойствами и не эффективны при позднем введении их на стадии выраженной токсемии. Учитывая данные литературы и приведенные результаты о биологических свойствах специфических иммуноглобулинов, целесообразно провести исследования по разработке комплексного противосибиреязвенного препарата на основе специфических бактериофагов, моноклональных антител и антибиотиков для экстренной профилактики и лечения сибирской язвы.

Выбор направления исследований, в конечном итоге, зависит от квалификации специалистов, научно-технической базы и финансирования работ.

ЛИТЕРАТУРА

1. Vorobjev A.A.ei al. "Criterion Rating" as a Measure of Probable Use of Bioagents as Biological Weapons (presented to the Working Group on Biological Weapons Control of the International Securih and Arms Control, National Academy of Sciences, Washington. DC. 1994).
2. Черкасский Б. Л. Сибирская язва в современном мире. // Вопросы эпидемиологии некоторых зоонозов. М., 1975.
3. Каркишенко Н Н. Лекарственная профилактика.- М: 2001- 752 с.
4. Маринин Л.И.. Онищенко Г.Г. и др. Микробиологическая диагностика сибирской язвы.-М.: BНУНММЗРФ, 1999,-224 с.
5. Онищенко Г.Г., Васильев Н.Т., Литусов Н.В. Сибирская язва: актуальные аспекты микробиологии, эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики. - М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999, - 448 с.
6. Инструкция и методические указания по лабораторной диагностике, профилактике и лечению сибирской язвы у людей.-М., 1982.-61 с.
7. Садовой Н.В.. Кожухов В.В. Сибирская язва: актуальные аспекты микробиологии, эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики.- М.. 1999,- 448 с.
8. Kutter Elilizabet. Phage therapy: bacteriophages as antibiotics. 1997
9. Barrow P.A. and I.S. Sootliill - Bacieriophage Therapy and renewed assessment of the Potential.//Trends Microbial. 1997. v.5 pp.268-271.
10. Онищенко Г.Г., Алешкина В.А., Афанасьева С.С. и др., Иммунологические препараты и перспективы их применения в инфектологии,- М.: ГОУВУНМЦМЗЗФ, 2002, -607 с.
11. Berkman S.A., Lee M.L., Gall R.P. Clinical uses of intravenosus immunoglobulins // Annals of international medicine. - 1990. - vol119, N4. - P. 278-292.
12. Sedlacek H.H., Gronski P., Hofstaetter et al. The biological properties of immunoglobulin G and its split products [F(ab)2 and Fab] // Klin Wochenschr., - 1983. - vol.61.- N13. - pp.723-735.
13. Кравец И.Д., Попов В.Г., Галиев А.Х., и др. Способ получения диагностических препаратов антител к соматическому антигену B.anthracis из коммерческой преципитирующей противосибиреязвенной сыворотки // Иммунология. - 1982. - № З.-С. 52-54.
14. Ашмарин И.П., Тарумов B.C., Попов В.Г.и др. Опсонизнрующая активность иммоноглобулинов противосибиреязвенной сыворотки. - Лабораторное дело, 1980, №5 с. 257-420.
15. Кеннетф Р.Г., Дж. Мак-Керна, Бехтол К.Б. - Моноклональные антитела.-М., Медицина.. 1983.-416 с.
16. Haber E., KrauseR.M. (eds) Antibodies of human diagnosis and Therapy. New York: Raven Press, 1977.
Zurawski V. Jr., Uber E., Black P.H. Production of antibody to tetanus toxoid by continous human lymphobeastoid cell eines. Science. - 1978.

<< cодержание

Сборник докладов I Российского симпозиума по биологической безопасности
Copyright © Комитет ученых за глобальную безопасность и нераспространение оружия массового поражения