<< на главную
<< назад

РАЗРАБОТКА ЭЛЕКТРООПТИЧЕСКИХ СИСТЕМ ДЕТЕКЦИИ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ

В условиях сложных технических и биотехнологических производств вероятность возникновения экологических и техногенных катастроф, связанных с выбросом во внешнюю среду опасных для человека бактериальных агентов, крайне велика. Правильная и своевременная оценка сложившейся чрезвычайной ситуации на основе инструментальных измерений имеет большое значение для принятия адекватных мер

Существующие инструментальные методы детекции бактериальных агентов (БА) весьма трудоемки. Основная сложность заключается в том, что клетки микроорганизмов в процессе своего развития постоянно меняются. Например, бактерии могут иметь как вегетативную, так и споровую форму, вирусы могут находиться как в суспензии, так и внутри клеток. Данные обстоятельства определяют широкий спектр подходов и методов детекции микроорганизмов.

В настоящее время существует ряд предварительных и точных методов детекции микроорганизмов, которые, дополняя друг друга, позволяют в итоге осуществлять детекцию конкретных клеток. Предварительные методы целесообразно использовать для ранней детекции, поскольку они хорошо автоматизированы и удобны при проведении анализа и получении результатов. К ним относятся, например, электронная микроскопия, газожидкостная хроматография, масс-спектрометрия. Однако ответить на вопрос, какой штамм клеток микроорганизмов детектируется, они не могут.

Для более точной (селективной) детекции наблюдаемых клеток микроорганизмов и описания их активности используют точные методы, например, иммуноферментный, флюоресцирующих антител и т. д. Однако они уступают предварительным методам в скорости проведения детекции. Кроме того, они требовательны к условиям проведения детекции, участию человека, качеству расходуемых материалов и степени автоматизации.

Поскольку не существует единого метода, удовлетворяющего условиям чувствительности, специфичности, а также скорости детекции клеток микроорганизмов, то возникает необходимость в поиске и разработке новых более совершенных подходов.

Важно отметить, что уровень общеизвестных методов детекции в России и за рубежом одинаков. Однако в целом наше государство проигрывает развитым странам в вопросах технологии и организации применения этих подходов. Один из перспективных и принципиально новых способов связан с характеризацией клеток в неоднородном переменном электрическом поле (НПЭП) в широком частотном диапазоне.

Взаимодействие бактерий, клеток, дрожжей, грибов с НПЭП сопровождается движением ее положительных и отрицательных электрических зарядов по всему объему клеток микроорганизмов. В результате поляризации в объеме клеток формируется индуцированный дипольный момент. Его величины и коэффициент поляризации зависят как от амплитудно-частотных характеристик электрического поля, так и от индивидуальных физико-химических параметров самих клеток.

Поляризованные клетки микроорганизмов в непроводящей суспензии под действием силы НПЭП приходят в поступательное движение. Такое явление называется диэлектрофорезом. В НПЭП наблюдаются следующие эффекты: направленное перемещение и осаждение клеток на электродах; ориентация клеток вдоль силовых линий электрического поля; образование кооперативных цепочек; деформация клеток; вращение одиночных клеток; кооперативное вращение клеток друг относительно друга и т д. (рис. 1, 2)

Рис. 1.   Под действием электрического поля эритроциты человека притягиваются к электродам и деформируются
Рис. 1. Под действием электрического поля эритроциты человека притягиваются к электродам и деформируются

Рис. 2.  Под действием электрического поля бактерии притягиваются к электродам и ориентируются вдоль силовых линий
Рис. 2. Под действием электрического поля бактерии притягиваются к электродам и ориентируются вдоль силовых линий

Новый метод

Группа исследователей из лаборатории экспериментальной аэробиологии Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» (ГНЦ ВБ «Вектор») Роспотребнадзора под руководством ведущего научного сотрудника, кандидата технических наук Талгата Бакирова в своем проекте использует уникальный и довольно сложный характер поведения клеток в НПЭП, связанный с их индивидуальными физико-химическими характеристиками. Ученые положили его в основу разработки электрооптических систем детекции микроорганизмов, экспрессного мониторинга их морфометрических характеристик и физиологических параметров — фазы жизненного цикла, метаболического статуса и пр., основанных на оптической детекции эффектов поляризуемости клеток при действии на них зондирующего электрического поля. Основные результаты получены благодаря усилиям высококвалифицированных специалистов: В.М. Генералова, А.В. Пак, М.В. Кручининой, Б.Ф. Ведерникова, Ю.В. Марченко, А.А. Медведева, И.С. Андреевой, А.С. Сафатова, Ю.Н. Мистюрина, Г.А. Буряк, Е.П Сухенко.

На клетки в НПЭП действует сила , которая в простейшем варианте (для сферически симметричных однородных частиц) формирует дипольный момент

где m— диэлектрическая проницаемость среды (электролита); r — радиус частицы; — фактор Клаузиуса-Моссоти

,

где — комплексная диэлектрическая проницаемость электролита и биологической частицы (в комплексной диэлектрической проницаемости кроме диэлектрической проницаемости учитывается и проводимость :

Данное выражение строго указывает, что сила, действующая на клетку, зависит как от амплитудно-частотных и пространственных характеристик электрического поля, так и от физико-химических свойств самой клетки. Комплексная диэлектрическая проницаемость каждой конкретной клетки определяется самыми разнообразными характеристиками. Среди них, например, можно выделить соотношение тех или иных составных химических компонентов, объем, форму, особенности пространственного строения.

Диэлектрофоретическая сила уравновешивается силой вязкого трения , которую испытывает клетка со стороны набегающего потока вязкой среды. Для сферической клетки

,

где n — динамическая вязкость среды; r — эквивалентный радиус клетки; v — поступательная скорость клетки относительно потока.

Равенство диэлектрофоретической силы и силы вязкого трения позволяет найти величину поляризации клетки:

На основе величины поляризации клетки и зависимости растяжения клетки x за время t воздействия электрического поля до максимального амплитудного значения A, рассчитываются ее жесткость:

и вязкость:

Новый метод измерения жесткости и вязкости эритроцитов человека имеет самостоятельное значение и может использоваться для диагностики многих заболеваний сердца и печени.

Знание амплитудно-частотной зависимости поляризации клетки позволяет рассчитать электрическую емкость, проводимость мембраны и цитоплазмы.

Экспериментальная установка

Последние исследования сотрудников лаборатории экспериментальной аэробиологии ГНЦ ВБ «Вектор» показали, что присутствие в суспензии бактериальных агентов можно идентифицировать с помощью разработанного ими алгоритма одновременного измерения нескольких характеристик клеток (морфометрических параметров, подвижности клеток в неоднородном переменном электрическом поле, поляризуемости на различных частотах электрического поля, электропроводности цитоплазмы и мембраны, электрической емкости мембраны, амплитуды деформации, жесткости и вязкости клеток, степени агломерации, индекса деструкции в электрическом поле, цвета клеток).

Рис. 3.  Функциональная схема макета прибора для электрооптической детекции клеток микроорганизмов, экспрессного мониторинга их морфометрических характеристик и физиологических параметров
Рис. 3. Функциональная схема макета прибора для электрооптической детекции клеток микроорганизмов, экспрессного мониторинга их морфометрических характеристик и физиологических параметров

Специалистами из ГНЦ ВБ «Вектор» собрана экспериментальная установка для одновременной регистрации перечисленных выше характеристик клеток с помощью компьютерной программы распознавания изменений формы, положения и цвета клеток в процессе взаимодействия с неоднородным переменным электрическим полем на различных частотах. Составляющие прибора — пробоотборник микроорганизмов из воздуха и комплекс измерительной аппаратуры: микроскоп с видеокамерой, измерительная ячейка и компьютер. Функциональная схема макета прибора представлена на рис. 3, а фотография — на рис. 4. Установка проста, универсальна и не требует большого числа химических веществ и биологических маркеров.

Рис. 4.  Фотография макета прибора
Рис. 4. Фотография макета прибора

Измерительная ячейка состоит из предметного стекла, на поверхность которого методом напыления нанесены хромовые электроды (рис. 5). Расстояние между электродами 50·10-6 м, высота напыления 0,2·10-6 м. Между электродами расположена измерительная камера. Измерительная ячейка устанавливается на подвижный стол микроскопа, с помощью которого осуществляется наблюдение за микроорганизмами. Электроды измерительной ячейки подключают к генератору напряжения. Характеристики переменного напряжения контролируются осциллографом. От генератора на измерительную ячейку подается гармоническое напряжение в частотном диапазоне 104–107 Гц. В компьютере установлена оригинальная программа распознавания образов клеток и расчета коэффициентов поляризации клеток и всех вышеуказанных характеристик. Она позволяет на основе видеозаписи динамики движения клеток в НПЭП подсчитать их количество, координаты, скорость движения — v, радиус клетки — r, площадь, рассчитать для каждой клетки коэффициент поляризации, построить гистограммы распределения поляризации клеток, степени агрегации клеток, индекса деструкции в электрическом поле, цвета клеток и т.д. В состав программы будет входить подпрограмма расчета градиента напряженности электрического поля — в каждой точке пространства между электродами измерительной ячейки.

Рис. 5.Фотография измерительной ячейки

Разработка ячейки для электрофореза и диэлектрофореза клеток (рис. 6) осуществлялась НТУ «Инженерно-технический центр», дочерней структурой предприятия Роскосмоса «ОАО Ижевский мотозавод Аксион-холдинг». Проект по объединенному методу клеточного анализа уже подан на совместный патент под названием «Способ комплексного анализа параметров живых клеток, устройство для его осуществления и его вариант».

Коэффициент поляризуемости

Подвижность биологических частиц в неоднородном переменном электрическом поле определяется коэффициентом поляризуемости, который зависит от частоты внешнего электрического поля. Величина коэффициента поляризуемости для различных биочастиц может служить основой для их детекции. Систематическое экспериментальное определение спектров поляризуемости различных биочастиц и составление базы данных по аналогии с инфракрасными спектрами поглощения органических веществ позволит провести экспресс-идентификацию бактериальных возбудителей инфекций или различать раковые или нормальные клетки. Измерение коэффициента поляризуемости различных биочастиц, например, аэрозольных биочастиц или форменных элементов крови будет проводиться в растворах с помощью создания неоднородного высокочастотного электрического поля на оригинальных устройствах.

Таким образом, данный подход позволяет определить в совокупности 19 параметров конкретной частицы: радиус, площадь, цвет, коэффициент поляризации, дипольный момент, индекс агрегации, индекс деструкции в электрическом поле, скорость поступательного движения БА, жесткость, вязкость, электрическую емкость, проводимость мембраны, проводимость цитоплазмы, частотную границу между областями положительного и отрицательного диэлектрофореза (равновесную частоту), амплитудно-частотную характеристику поляризации. Для суспензии микроорганизмов предлагается также построить гистограммы по всем измеряемым параметрам. Интерфейс программы для измерения характеристик клеток представлен на рис. 7.

Рис. 7.  Интерфейс программы для измерения характеристик клеток
Рис. 7. Интерфейс программы для измерения характеристик клеток

Кроме того, предлагаемый подход позволяет установить концентрацию микроорганизмов в суспензии, процентное соотношение интактных и инфицированных вирусом клеток, бактерий. Если учесть статистические параметры обработки, например, дисперсию, то количество параметров расширяется. Совокупное множество параметров является надежной базой для детекции конкретных микроорганизмов, их морфометрических характеристик и физиологических параметров. Предлагаемый подход позволит описать клетки микроорганизмов 10–38 параметрами, что значительно больше, чем предлагают любые другие методы.

ОБ АВТОРАХ

Талгат Сальманович Бакиров — ведущий научный сотрудник, кандидат технических наук, заведующий лабораторией экспериментальной аэробиологии Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора.
Елена Демыгина — корреспондент журнала «В мире науки».

О ФЕДЕРАЛЬНОЙ ЦЕЛЕВОЙ
НАУЧНО - ТЕХНИЧЕСКОЙ ПРОГРАММЕ

«Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2002–2006 годы».

Из интервью председателя совета директоров компании Molecular Devices and Tools for Nano Technology (NT­MDT), члена комиссии ФЦНТП ВАЛЕРИЯ БАРАНОВА экспертному каналу Opec.ru.

«Нам кажется, что роль ФЦНТП в становлении инновационной деятельности в России велика. Ведь в рамках этой программы стали реально поддерживаться научные проекты, продукция которых потенциально может быть востребована рынком. Пусть целевое финансирование научных программ с некоторых позиций считается недостаточно совершенным, но оно направлено на создание реальных продуктов. Сейчас есть деньги, есть желание, чтобы прикладная наука имела будущее. Так создаются ростки новой системы, объединяющей группы, направления и конкурсы. Прошел всего лишь год с начала работы программы, он показал как положительные стороны, так и недостатки и заставил задуматься над их устранением. Теперь нужно конструктивно подойти к решению возникших вопросов и на основе конкретных предложений провести изменения в системе отбора проектов. Необходимо брать конкретные документы, результаты, анализировать их, вносить изменения в положения, рабочие регламенты комиссий, в порядок отбора проектов и в схему выработки критериев, может быть, скорректировать направления. Нужно исходить из инновационного подхода: управлять процессами, а не людьми. Ведь именно это приводит к постоянному совершенствованию системы в целом. Таким же образом нужно действовать и в комиссии по ФЦНТП, должно быть непрерывное улучшение процесса».

Sciencerf.ru

<< на главную
<< назад