<< на главную
<< назад

Геномные проекты и генная терапия: входные ворота для следующего поколения биологического оружия

Блэк Дж.Л.

(Black J.L., Mayo Clinic and Foundation, Rochester, NN; 432d livil Affairs Battalion (Airborne), Green Bay, WJ, USA.
Genome projects and gene therapy: gateways to next generation biological weapons // Milit. Med. – 2003. – Vol.108, № 11. – Р.864-871)

Точка зрения, изложенная в этой статье, является мнением автора и не отражает представлений Министерства обороны, Правительства США и Клиники и фонда Мэйо по этой проблеме.

Геномные и геннотерапевтические исследования позволяют добиться крупных успехов в лечении болезней человека, животных и растений. Однако следует помнить, что у этих исследований имеется и военный аспект. Они дают возможность создать новый вид биологического оружия – так называемого геномного. Данная статья является первой, в которой эта угроза подробно обсуждается с научной точки зрения. Несмотря не то, что Соединенные Штаты и многие другие государства, подписавшие ранее договоренности о запрещении биологического оружия, согласились не использовать его, исторический опыт показывает, что нередко применялись и такие виды оружия, которые, по официальным данным, были ликвидированы. В статье содержится обзор литературы по основным исследованиям в области геномики и генной терапии, который сопровождается обсуждением того, каким образом с помощью результатов этих исследований может быть создано оружие. В ней описывается также, как может быть развернуто геномное оружие, как может быть обнаружено это развертывание и какие могут быть предприняты политические меры и исследования, способствующие снижению этой угрозы. Цель написания этой статьи состояла в том, чтобы обратить внимание на существование такой опасности и побудить руководителей в области общественного здравоохранения, науки, политики и военного дела принять все меры к ее ликвидации.

Введение

Существует множество геномных проектов и программ, цель которых состоит в определении последовательностей и характеристик генов того или иного вида организмов. Эти проекты, включая и проект генома человека, будучи объединенными с генной терапией, приобретают новый этический, правовой и социальный смысл. Он заключается в том, что такое совмещение позволяет использовать полученную информацию для разработки более современного вида биологического оружия (1). Однако в настоящее время литературы о неправомерном использовании геномных исследований в сочетании с работами по генной терапии в военных целях крайне недостаточно. Задача этой статьи состоит не в том, чтобы помешать получению пользы от этих исследований, а в том, чтобы побудить к размышлениям и обсуждениям по поводу угрозы, которую представляют эти технологии в плане создания нового типа биологического оружия, называемого «геномным оружием». Данный термин не идентичен понятию «генное оружие», которое упоминается в обычной прессе и в некоторых статьях (2), поскольку слово «ген» соответствует лишь части ДНК в ядре клетки, ответственной за выработку белков как основы этого оружия, Это определение слишком узко, так как не учитывает возможности использования других регионов генома. Кроме того, практическим источником потенциальных биологических агентов являются и геномные последовательности других видов, особенно тех, которые способны вызывать различные болезни.

В настоящей статье вначале дается обзор современного состояния геномных исследований, а затем представлен обзор исследований по генной терапии и дано описание общих векторов, используемых в экспериментах по генной терапии. Эта информация является основой для понимания опасности возможного применения полученных данных для создания биологического оружия. После этого излагаются теоретические характеристики пригодных для этого векторов и некоторые сценарии применения геномного оружия. Далее обсуждаются эпидемиологические последствия такого применения. И, наконец, предлагается перечень мер, которые следует в первую очередь предпринять для предупреждения создания геномных средств ведения биологической войны.

Обзор геномных проектов

Геномные исследования начались в эру глубоких изменений в медицине и обществе. Первый проект по геному человека завершился в июне 2000 г., и в феврале 2001 г. исследователи Международного консорциума по последовательности генома человека (3) и компании “Celera Genomics” (4) опубликовали два сообщения с описанием и одно – с анализом этого проекта. Однако работа по составлению полной последовательности человеческого генома продолжается до сих пор. Параллельно предпринимаются усилия по изучению полиморфизма отдельных нуклеотидов в последовательности человеческого генома и определению места, последовательности и функций всех генов. Не дожидаясь того, когда станут известны функции всех человеческих генов, проводится анализ их сцеплений с тем, чтобы выяснить, какие части генома ассоциируются с особенностями людей и их болезнями. В последующем будет проведен более тщательный анализ с целью выявления специфических последовательностей ДНК, ответственных за те или иные заболевания. Ожидаются также исследования по анализу мутаций и идентификации генного полиморфизма и по оценке частотности аллелей, чтобы в конце концов определить восприимчивость человека к самым разным болезням. В дальнейшем предстоит идентификация характеристик экспрессии генов в ответ на действие экзогенных агентов, например, лекарственных препаратов или факторов окружающей среды, и патологических изменений в самом организме, что позволит ускорить разработку новых лекарств и методов терапии. Ко времени появления первых публикаций по геному человека насчитывалось всего лишь 483 мишени для воздействия всех лекарств, поставляемых на рынок, но уже сейчас известно, по-видимому, о более чем 50000 генов человеческого генома, многие из которых могут быть такими мишенями (3,5,6). В следующие несколько десятилетий будет разработано множество новых терапевтических препаратов, причем скорость их появления на рынке будет настолько высокой, что сможет сбить с толку любого практикующего врача.

К стадии завершения подходят и многие другие программы по геномным последовательностям, в том числе для таких микроорганизмов, как Haemophilus influenzae (7), Mycoplasma genitaluim (8), Saccharomyces cerevisiae (9), Methanococcus jannaschi (10), Escherichia coli (11), Mycobacterium tuberculosis (12), Caenorhabditis elegans (13), Drosophila melanogaster (14), Yersinia pestis (15) и множества других. Эти геномы сейчас сравниваются с человеческим, что имеет важное значение для выявления подобия видов, возраста генов, скорости их изменения и способов функционирования уникальных генов, включая их токсичность для человека. Изучаются геномы и многих других видов, в том числе микроорганизмов, ответственных за возникновение болезненных состояний у человека. Большая часть сведений, упомянутых выше, хранится в базе данных National Center for Biotechnology Information, которая доступна для любого человека в мире, имеющего доступ к Интернету.

Важные для поддержания жизни человека гены идентифицируются по их ДНК-последовательностям, ответственным за регуляцию этих генов. Разрушение последних может быть настолько вредным для здоровья, что они могут стать желанными мишенями для геномного оружия. Помимо этого, в настоящее время выявляются гены и других организмов, вырабатывающих вещества, вызывающие те или иные заболевания человека; они также могут служить основой для разработки подобного оружия.

Обзор исследований по генной терапии

Генная терапия определяется как экспериментальная методика, применяемая для лечения болезней посредством модификации клеточного генома для лечения заболеваний, вызванных нарушениями функций генов. Она может включать замену, модификацию, дополнение или регуляцию генов, ставших причиной болезни, с целью профилактики или прекращения развития заболевания (16-19). В некоторых случаях может проводиться вставка генов от других видов. В настоящее время векторами, используемыми для доставки генов, могут быть плазмиды или вирусные частицы, содержащие передаваемые гены, называемые трансгенами (16-19). Этот подход к лечению может также применяться для доставки терапевтических, кодирующих выработку протеинов генов, которые не являются обычной составной частью генетической структуры данного вида – например, гена фермента, активирующего действие лекарства, который усиливает лечебный эффект химического вещества непосредственно в конкретных тканях или в опухолях (20).

Проявление активности модифицированных генов или размещение новых экспрессируемых генов в клетках пока еще не полностью понято. Некоторые считают, что эти гены распространяют свое действие на другие гены, их белковые продукты и метаболиты. При экспрессировании в организме введенные гены могут проявлять непредусмотренные эффекты, например, нарушают механизм регуляции других генов, которые противодействуют трансгену, в попытке поддержать гомеостаз клетки. Другие исследователи отмечают, что в нормальных условиях активация подавленных генов может приводить к побочным эффектам. Существуют также опасения, что гены, активность которых гасится посредством метилирования ДНК, могут становиться барьером для геннотерапевтических препаратов, чем можно частично объяснить неустойчивую экспрессию, наблюдаемую в некоторых исследованиях (21).

В настоящее время генная терапия находится на экспериментальной стадии и требует строгого методического обоснования из-за возможности летальных побочных эффектов, которые уже имели место (22). Тем не менее, генная терапия теоретически возможна, и любым из подходов к изучению ее практического применения можно злоупотребить в целях создания геномного оружия.

Введение экспрессируемого гена в клетки с интеграцией в геном и без таковой

Для введения гена в клетки больного хозяина используются различные векторы (17, 23). Как будет описано ниже, некоторые ретровирусы в качестве векторов могут приводить к перманентной интеграции трансгена в геном хозяина и более долговременной экспрессии гена. Другие векторы не приводят к перманентной интеграции в геном, и они более применимы для кратковременной экспрессии трансгена. Цель этого подхода состоит в том, чтобы заставить клетки хозяина начать продуцировать биологически активные вещества, кодируемые трансгеном, и изменить таким образом влияние дефектного гена. Можно применить этот подход, например, для введения генов, обеспечивающих защиту от инсульта (связанного, в частности, с кислородной недостаточностью и другими метаболическими нарушениями или эксцитотоксическими приступами) (24).

Введение экспрессирующих векторов, продуцирующих РНК  с антисмысловой последовательностью, для подавления дефектного гена

В ситуации, когда ген активно продуцирует вызывающую болезнь копию, может быть эффективным использование ДНК-последовательностей, продуцирующих антисмысловую ДНК (23). Антисмысловой вектор продуцирует РНК, комплементарную мРНК гена, являющегося причиной заболевания. Обе молекулы РНК тесно связываются между собой и образуют двунитевую РНК, которая не может транслироваться в белок и метаболизируется клеткой. Если антисмысловые нити продуцируют избыток мРНК, образуется лишь очень небольшое количество белка, что исключает токсический эффект вызывающего болезнь гена.

Вставка генов, позволяющих активировать предшественник лекарственного препарата

В этом случае доставляется кодирующий фермент ген, экспрессируемый в целевой ткани, например, опухоли. Таким образом, в тканях синтезируется белок-предшественник, который метаболизируется до активного состояния при помощи трансгенного фермента и вызывает нужный эффект. При использовании этого метода для лечения злокачественных опухолей необходимо применять систему доставки со специфическим или предпочтительным для данной опухоли геном. С другой стороны, для уменьшения токсического действия при химиотерапии предлагается вводить в нормальные ткани гены лекарственной устойчивости (20).

Вставка генов, программирующих гибель клеток

При этом методе генотерапии в ткани доставляются гены, ускоряющие гибель клеток, которые инициируют каскадный комплекс, приводящий к смерти последних. Представляется, что этот подход полезен при генотерапии рака.

Введение трансгенов, кодирующих антигены при трансплантации органов или тканей

Этот подход применяется при выращивании генноинженерных животных (например, свиней), дающих возможность изменить экспрессию антигенов и тем самым сделать ткани животных более похожими на человеческие с точки зрения иммуногенности и, следовательно, более пригодными для трансплантации реципиенту или для получения экспрессируемых защитных белков (25).

Векторы, применяемые при генной терапии

Для введения генов в клетки используются переносящие их векторы. Они делятся на две категории (18, 19): вирусные и невирусные (табл. 1). В исследованиях в основном используются вирусные векторы трех типов: ретровирусные, аденовирусные и аденовирусоассоциированные, хотя сейчас изучается применение в этом качестве и других вирусов. Основным невирусным вектором является голая ДНК (плазмида).

Таблица 1. Генотерапевтические векторы и их характеристики

Векторы

Размер вставки

Геном вектора

Деление клеток

Экспрессия

Преимущества

Недостатки

Ретровирусы (модифицированный вирус Молони или лентивирусы)

7-11 т.п.о.

РНК

Необходимо за исключением лентовирусов

Перманентная

Может интегрироваться в геном клеток-мишеней

Инсерционный мутагенез

Аденовирусы

35-40 т.п.о.

ДНК

Нет необходимости

Кратковременная

Высокая эффективность трансдукции, легкая продуцируемость с высоким титром

Воспаление и иммунная реакция ткани в месте введения

Аденоассоциированные вирусы

5 т.п.о.

ДНК

Нет необходимости

Долговременная

Высокая эффективность трансдукции

Инсерционный мутагенез, трудность продуцирования, проблемы выбора ткани

Вирус простого герпеса

30 т.п.о.

ДНК

Нет необходимости

От кратковременной до перманентной

Большая вставка

Нейротоксическая и цитопатическая склонность

Невирусные векторы (плазмидная ДНК, олигонуклеотиды)

Нет ограничений

ДНК или РНК

Нет необходимости

Кратковременная

Безопасность и низкая стостоимость

Малая эффективность, может модулировать экспрессию только эндогенного гена


Ретровирусы

В качестве носителей рекомбинантного генетического материала официально использовалось только лишь несколько известных ретровирусов позвоночных. В большинстве утвержденных методик переноса генов применяются ретровирусные векторы (19). Эти векторы прикрепляются к клеточной поверхности через интерактивный домен оболочечного протеина (26) с последующим опосредованным рецептором эндоцитозом (27). Первоначально большинство ретровирусных векторов основывалось на вирусе мышиной лейкемии Малони (19, 26, 27). Он считается относительно безопасным, хорошо изучен, и его генетические особенности достаточно известны и понятны. Однако совсем недавно главными в ретровирусной генотерапии стали лентивирусы. В отличие от большинства ретровирусов, лентивирусы не требуют для инфицирования делящихся клеток (28). Ретровирусы могут вставлять гены в геном клеток хозяина, что обеспечивает более длительную экспрессию трансгена, но может вести к мутациям в момент ввода (19). Размер вставки относительно невелик по сравнению с аденовирусами (29-31).

Исследователи обычно используют репликационно-дефектные ретровирусы, не содержащие часть генов природного типа, с целью получения нужных количеств инфекционных частиц (32). Однако сейчас возрастает интерес к применению реплицированных ретровирусных частиц при лечении рака. Дело в том, что первичная инокуляция опухоли традиционно производится путем инъекции, которая не всегда ведет к трансфицированию всех опухолевых клеток. Реплицированные вирусы, высвобождаемые из раковых клеток в межклеточное пространство, могут приводить к тому, что все злокачественные клетки становятся трансфектными или погибают. Однако при продуцировании ретровирусных векторов достигаемые при этом титры невелики по сравнению с некоторыми другими векторами (30). Кроме того, их отличает высокая степень генетической вариабельности из-за ошибок обратной транскриптазы, что может приводить к значительным уровням мутаций, вплоть до 5%, и вообще к непредсказуемым последствиям (17). Поскольку некоторые ретровирусы требуют активно делящихся клеток (17,32), данный подход имеет перспективы в плане лечения опухолей центральной нервной системы, так как он обеспечивает селективную трансфекцию митотически активных опухолевых клеток. Кроме того, мозг обладает определенной привилегией с точки зрения иммуногенности, обеспечивающей ему возможность ослабления иммунной реакции на вектор, а спинномозговая жидкость не инактивирует ретровирусы.

Аденовирусы

Аденовирусные векторы, применяемые для генной терапии, генетически модифицируются путем деления различных компонентов вирусного генома, в результате чего создаются промежутки для вставки посторонних генов, и вирус становится неспособным к репликации при внедрении в хозяина (16-19). При использовании с самыми разными типами клеток эти векторы обладают высокой эффективностью трансдукции. Они могут готовиться с высокими титрами и не включают ДНК в геном клетки-хозяина. Однако их экспрессия часто снижается уже через 2 недели и становится совсем незначительной через 4 недели, возможно, вследствие индуцирования иммунных реакций на вирусный или трансгенный белок. Совсем недавно появились рекомбинатные аденовирусы, которые притупляют иммунную реакцию хозяина, что позволяет экспрессировать гены в течение более продолжительного времени. Некоторые из новейших аденовирусных векторов могут включать очень большие трансгены. Обычно аденовирусы не являются причиной литических инфекций или острой нейротоксичности.

Адено-ассоциированные вирусы

Адено-ассоциированные вирусы способны заражать клетки только при содействии неродственных вирусов-помощников (обычно аденовирусов) (17-19). Они встраиваются в геном хозяина и остаются там в качестве провируса до тех пор, пока не появится вирус-помощник. Как только это произошло, может начаться транскрипция с участием генов, заимствованных у вируса-помощника. Эти вирусы не требуют репликации в клетке-мишени для ее инфицирования и способны инфицировать большое количество культур клеток человека, тестированных к настоящему времени. Однако вектор этого типа довольно трудно продуцировать с высокими титрами. Показано, что они могут экспрессировать трансгены до 3 месяцев. Продемонстрирована также способность адено-ассоциированных вирусных векторов хорошо реплицироваться в клетках глиомы. Отсюда можно предположить, что эти векторы могут быть полезными для использования трансгенов, имеющих отношение к центральной нервной системе.

Другие вирусные векторы

Представляет интерес в этом плане вирус простого герпеса, поскольку он может вызывать латентную инфекцию центральной нервной системы. Стали известными несколько первых случаев их применения для доставки трансгенов к опухолям мозга. Среди трудностей использования этих векторов можно привести тот факт, что у данного вируса довольно низка эффективность инфицирования по сравнению с другими вирусными системами, что не дает возможности длительное время поддерживать экспрессию трансгенов, и, кроме того, вирус склонен вызывать нейротоксические и цитопатические эффекты. К тому же у вируса простого герпеса довольно крупный геном и не совсем поняты функции всех его генов (19).

Невирусные векторы

Невирусные векторы, такие как голая ДНК в форме плазмид или олигонуклеотидов, могут доставлять трансгены при помощи липосом, электропорации или баллистических методов (16,17,19). Главная проблема механизма доставки трансгена этого типа заключается в кратковременности экспрессии. Ее можно преодолеть лишь путем добавления вирусных последовательностей, которые позволяют встроить трансген в геном клетки-хозяина. Липосомы – это катионные частицы липидов, предназначенные для защиты ДНК от внеклеточного распада и обеспечивающие механизм переноса ДНК в клетки-мишени за счет слияния липида. Инокуляция комплексов липосома-ДНК в мозг ведет к относительно длительной экспрессии, хотя в одном из исследований внутривенное введение обеспечивало экспрессию трансгена в ряде тканей по меньшей мере в течение 9 недель без признаков появления эффекта токсичности (33). При электропорации используется электрический ток, облегчающий плазмидам доступ внутрь клеток, но на практике этот метод не подходит для большинства случаев клинического применения. В баллистических механизмах используются покрытые ДНК металлические микрочастицы для того, чтобы внедрить ДНК в клетки, легко доступные для применения этого метода (например, фибробласты кожи).

Системы регуляции экспрессии трансгенов

На ранних этапах генной терапии использовались системы доставки генов без контролирования экспрессии трансгенов, в качестве которых служили вирусные промоторы естественного происхождения (34). Однако отсутствие контроля могло привести к слишком высокому уровню экспрессии, способному вызвать токсический эффект в отношении клеток. В последнее время были разработаны регуляторные системы в виде химер из прокариотических или эукариотических элементов, обеспечивающих лучший контроль. В литературе приводятся четыре примера таких регуляторных систем, включающие транс-активаторные системы с подавлением тетрациклином (35), системы, основанные на прогестероновом антагонисте RU 486 (36); системы на основе гормона насекомых экдисона (37) и системы на основе рапамицина (38).

Подробное рассмотрение всех этих систем не является предметом этой статьи, но в качестве примера можно кратко охарактеризовать регуляторную систему с тетрациклином. В ней для контроля трансгена используется химерный реагирующий на тетрациклин активатор. В отсутствие тетрациклина активатор связывает и подавляет регулируемый им промотор, а в присутствии этого антибиотика активатор уже не подавляет промотор и происходит активация трансгена. Отсюда, основываясь на количестве вводимого хозяину тетрациклина, можно регулировать экспрессию трансгена до титра, при котором его транскрипционная активность будет обеспечивать желаемый эффект. Важно было поддерживать небольшую экспрессию гена после начальной трансфекции до того, как вводился индуктирующий агент (34,35).

Для регулирования активности трансгенов можно также применять тканеспецифические промоторы, но только в случае, когда регуляция касается этой специфической ткани. Например, как показано в одном из исследований, размещение родопсинового промотора перед геном, кодирующим протеин с зеленой флуоресценцией, будет вызывать экспрессию этого гена только в сетчатке (39). Предпринимаются исследования по определению последовательностей у промоторов с выборочной активностью в специфических тканях. Исследователи пытаются также определить лекарства, способные модифицировать темпы транскрипции последовательностей специфических промоторов (40,41).

Способность регулировать экспрессию трансгенов обеспечивает ряд уникальных возможностей для разработки оружия. Особенность биологической войны состоит в том, что человек получает поражение незаметно для него, а действие этого оружия проявляется лишь позднее. То же происходит и в случае с тканеспецифическими промоторами: когда обнаруживается их применение, специфические ткани уже могут подвергнуться действию трансгена.

Особенности идеальных генных векторов

Идеальный вектор для генной терапии еще только должен быть создан. Для его разработки следует иметь в виду ряд факторов, а именно:

– структуру вектора (включая промоторы, типы экспрессируемых протеинов, способность к регуляции);
– максимальный размер вставки, которую может включать вектор;
– необходимость (или ее отсутствие) в клеточном делении для трансфекции;
– продолжительность экспрессии трансгенов и неблагоприятное влияние вектора на трансфицируемые клетки и на иммунную систему хозяина.

Во многих отношениях характеристики, свойственные наилучшему вектору для генной терапии, те же, что и у вектора как эффективного агента для геномной войны:

– Небольшая стоимость, чтобы можно было изготовлять в больших количествах.
– Стабильность при хранении в обычном состоянии (т.е. в лиофилизированной форме).
– Простая и небеспокоящая вставка экспрессируемого генетического материала в клетки с обеспечением эффективности.
– Простая система доставки (например, аэрозольным, пероральным или чрезкожным способами).
– Регулируемость.
– Долговременность инкорпорации генетического материала в геноме.
– Отсутствие реакции иммунной системы.
– Способность принимать и передавать крупные трансгены.
– Отсутствие склонности к индуцированию мутагенеза у вставки в геноме.
– Нацеленность на специфические (конкретные) виды ткани.
– Способность к бессимптомной саморепликации.
– Способность к защите от ошибочной трансфекции непредумышленных целей.
– Способность к инактивации векторов/трансгенов.

Идеальный вектор для генной терапии должен быть недорогим, чтобы была возможность получения его больших титров и чтобы с ним можно было бы легко обращаться и собирать его большой урожай. Этот вектор должен расти в легко поддерживаемых культурах клеток млекопитающих или бактерий; необходима возможность получать его в виде не содержащих клеток и пирогенов экстрактов при использовании простых и общедоступных процедур. Способность к автоматизации последних могла бы в дальнейшем сделать более простым производство больших количеств вектора. Существенное значение имеет также низкая частота рекомбинаций и мутаций в ходе производства.

Вектор должен быть стабильным при хранении в обычном состоянии. Например, идеальный вектор должен лиофилизироваться и содержаться при комнатной температуре; желательно, чтобы его можно было использовать прямо в этом состоянии после минимальных восстановления или обработки. По существу, хранение должно быть примерно таким же, как и в случае сибиреязвенных спор в биологическом оружии.

Вектор должен обладать способностью незаметно вводить экспрессируемый генетический материал. Преимущество всегда следует отдавать вектору, который не вызывает вирусного синдрома или нарушения нормального функционирования клеток. В конструкциях, которые могут подвергаться регуляции, трансген в отсутствие регулятора не должен находиться в состоянии, обеспечивающем основной уровень экспрессии. Это позволяет предотвратить ту или иную потенциальную токсичность в отношении клеток хозяина, обусловленную нерегулируемой экспрессией трансгенного белка.

Вектору требуется простая система доставки. Для  парентерального введения предпочтителен вектор, который может безболезненно проникать в целевые клетки хозяина при вдыхании аэрозоля, проглатывании или накожном применении. Вектор должен также поддерживать долговременное инкорпорирование генетического материала в геном клеток хозяина для обеспечения длительной продукции протеинов. Он не должен вызывать иммунных реакций, поскольку они ассоциируются с отсутствием и недостатком экспрессии трансгена. Вектор должен быть способным включать в себя или передавать достаточно крупные генные вставки. Пока что приемлемый размер вставки является ограничивающим фактором его применения. Многие из генов, которые могли бы подходить для трансфекции в клинических целях, имеют размер, больший допустимого, что ограничивает их применение в современных векторах.

Вектор не должен индуцировать мутагенез при введении в геном. Однако считается, что ретровирусы склонны к этому. Такая склонность не является очень приятной для генной терапии, хотя подобный риск зависит от вероятной частоты проявления мутагенеза, гибели или трансформации трансфектируемых клеток или разрушении того же гена в массе клеток, достаточной для проявления симптомов. Идеальный ретровирус следует вставлять в спокойные области генома.

Вектор должен обладать способностью с высокой точностью находить нужный вид специфической ткани или обеспечивать экспрессию только в той ткани, которая требует лечения, за счет использования тканеспецифических промоторов. При генной терапии целью является экспрессия трансгена в клетках только тех тканей, на которые требуется воздействие. Доставка и экспрессия в других тканях может вызывать побочные эффекты.

Должен существовать механизм для предотвращения нежелательного трансфицирования людей. Это нужно потому, что высокоэффективный вектор может случайно попасть в организм тех, кто работает с этими агентами. В идеале, вектор должен задерживаться фильтром респиратора, а правильно подобранные процедуры, выполняемые с соблюдением стерильности, могут предотвратить случайное трансфицирование медицинского персонала. Кроме того, нужно сделать контролируемой саморепликацию с тем, чтобы была невозможной бесконтрольная вторичная инфекция. На все эти проблемы следует обращать особое внимание, поскольку трансфекция клеток нормальных индивидов, которые не дефицитны по данному трансгену, может приводить к нежелательным последствиям. В случае с индуцируемыми фоновыми векторами с присущими им необнаруживаемыми уровнями экспрессии эта проблема может быть устранена только тогда, когда лицо, ставшее свидетелем проявления их действия, само столкнется с индуктором. Наконец, могут оказаться предпочтительными способы индуцирования перманентного избирательного молчания вектора или приведения его в недееспособное состояние.

Геномная война

В оставшеся части этой статьи основное внимание будет уделено теоретическим характеристикам геномного оружия. Следует отметить, что дальнейшее обсуждение носит гипотетический характер и не имеет в основе какие-то исследования или опыт, полученный в полевых условиях, поскольку такая информация нигде не публиковалась. Сначала будет рассмотрена возможность боевого применения геномного оружия, основанная на временнЫх характеристиках (сравнение немедленного и запаздывающего эффектов). Затем будет обращено внимание на типы генов, которые могут использоваться в приспособленных для создания биологического оружия векторах для генной терапии. В следующем разделе будут обсуждаться возможные эпидемиологические характеристики боевого применения геномного оружия. И, наконец, будет представлен обзор возможных стратегий боевых действий с использованием этого типа биологического оружия.

ВременнЫе характеристики геномной атаки

Сценарии боевого применения геномного оружия определяются военными задачами, состоянием окружающей среды и целями, против которых это оружие используется, будь то люди или сельскохозяйственное производство. Существуют две зависимые от времени характеристики или особенности нападения с применением геномного оружия, а именно: нападение с кратковременным или продолжительным латентным периодом. В первом случае гены могут доставляться при помощи вектора, который инфицирует хозяина и вызывает быструю экспрессию трансгена, оказывающего вредное для здоровья действие. В этой ситуации представляется необходимым использование регулируемого вектора, и, наиболее вероятно, применяемый вектор будет трансфицировать все без разбору клетки хозяина, быстро вызывая токсическое действие. Этот вид нападения похож на использование более «обычного» биологического оружия. Продолжительность латентного периода может зависеть от того, насколько скоро начнет экспрессироваться токсичный ген, а сама экспрессия определяется типом используемого вектора, используемой дозой и тем, зависит ли эффект от репликации вектора. Например, вектор, который доставляет токсичный ген и одновременно обладает самореплицирующей способностью, может нуждаться в большем времени для проявления эффекта и по своему действию больше похож на традиционные биологические агенты. Векторы, которые могут находить специфическую ткань и оказывать на нее биологическое действие, могут немедленно вызывать у хозяина токсический эффект, поскольку при их применении транскрипция и трансляция могут происходить уже через минуты после введения гена.

Возможно, больший интерес вызывает сценарий с длительным латентным периодом, поскольку впервые в человеческой истории возникнет вероятность биологической войны, когда биологический агент может доставляться к цели задолго до планируемой атаки и проявлять свое действие в момент ее начала. При описании такого нападения используется термин «скрытый вирус» (“stealth virus”), но возможно, что при этом варианте боевых действий будет применяться и невирусный вектор. В случае генноинженерного вируса население может скрытно трансфицироваться, вероятно, ретровирусом, что ведет к инкорпорированию в геном хозяина индуцируемого трансгена или трансгена, продуцирующего фермент, преобразующий предшественник токсина. Позднее подвергшееся воздействию вируса население может быть обработано индуктором или веществом-предшественником, что инициирует воздействия, предусмотренные сценарием. Подход, предполагающий сценарий с длительным латентным периодом, намного сложнее, чем в случае со сценарием, когда требуется кратковременный латентный период, поскольку при существующей технологии его применения он подразумевает двукратное «экспонирование» населения (популяции): одно к вектору, а второе, последующее, к индуктору или предшественнику токсина.

Возможные трансгены для геномного оружия

Сейчас геном человека секвенирован, и среди составляющих его генов определен ряд жизненно важных (3, 4). Очевидно, что любой из этих генов может быть мишенью для будущих фармацевтических препаратов, но, кроме того, они могут быть и целями для боевых геномных агентов. Кроме того, сейчас с поразительной частотой появляются публикации об обнаружении все новых генных мутаций, которые ответственны за различные человеческие болезни. Эта информация также может быть использована для разработки таких агентов. В этих же целях могут применяться и так называемые токсические гены от других видов. Например, в военных целях в векторы могут вставляться токсические полипептиды бактериального происхождения.

Ниже приведены несколько общих категорий генов, которые могут использоваться в геномном оружии:

– Гены, существенные для жизни клеток
– Мутации, ответственные за наследственные болезни
– Токсические гены экзогенных видов
– Ген, кодирующий выработку фермента, обеспечивающего превращение предшественника токсина
– Векторы, поражающие отдельные человеческие популяции (например, конкретные этнические группы).

Трансфекция ферментом, обеспечивающим превращение вещества-предшественника, может иметь ограниченное применение, поскольку она требует, чтобы трансфицированный индивид позднее подвергался воздействию этого предшественника. Однако вероятна возможность того, что будет получена генная вставка, которая при помощи конвертирующей предшественник технологии сможет превращать обычно ингибируемую субстанцию в токсичную. Наконец, уже имеется ряд публикаций, в основном в обычной печати, по поводу того, что существует опасность изготовления вирусов или других векторов, которые могут выборочно инфицировать представителей той или иной расы. С этой точки зрения, анализ проекта генома человека показывает нам, что у разных этнических групп людей в генетическом отношении намного больше сходства, чем различий. Однако все же должны существовать и некоторые различия, и, возможно, одно или более из них может быть применено для получения боевых геномных векторов, специфичных для данной этнической группы. Возможны и другие сценарии применения геномного оружия, и только недостаток нашего воображения не позволяет охарактеризовать здесь все способы вывода из строя жертв путем использования этого оружия. Кроме того, уязвимыми для него мишенями являются не только Homo sapiens, но, вероятно, ими могут быть и сельскохозяйственные объекты.

Эпидемиологические особенности применения геномного оружия

Эпидемиология геномной войны будет иметь много сходств с другими формами биологической войны, о чем писали ранее Noach с соавт. (42). Понимание эпидемиологических особенностей последней может помочь при дифференциации вспышек болезни искусственного и естественного происхождения. То же можно сказать и по поводу боевых геномных агентов. Безусловно, большое значение имеет стратегия применения (например, трансфицирование с коротким или длительным латентным периодом), которая будет влиять на временной характер развития болезни. Можно ожидать, что количество случаев в единицу времени, представленное в виде графика, дает эпидемическую кривую, отражающую взрывной характер развития эпидемии. В случае боевых действий начало вспышки заболевания, вероятно, будет рассчитываться по времени таким образом, чтобы противник утратил боеспособность к моменту атаки. В случае террористического акта такой расчет будет предприниматься, вероятно, для того, чтобы удовлетворить какие-то символические требования. Однако даже при молчащих векторах некоторые люди немедленно проявляют симптоматику заболевания, несмотря на то, что предполагалось трансинфицирование с запаздыванием. Происходит это потому, что вектор, используемый для применения, по-видимому, вызывает симптомы вирусного заболевания, по крайней мере, у части подвергаемой инфицированию популяции. Помимо того, даже в системе, в которой необходимо индуцирование для экспрессии гена, она часто имеет низкий уровень, поскольку регуляторные системы не обладают 100%-й эффективностью. Кроме того, в зависимости от индуктируемого агента, который используется при требующей индукции атаке с запаздыванием эффекта, некоторые люди могут вступать в контакт с индуктором (например, с тетрациклином или с системой его индуцирования) и таким образом приобретать все признаки и симптомы, присущие проявлению действия трансгена. Возможно также, что во время внедрения гена, если вектор обеспечивает его инкорпорацию в геном, мутации могут происходить даже и тогда, когда это приводит к разрушению критически важного гена. Наиболее вероятно, что такое разрушение будет происходить беспорядочно и в случайных клетках и, следовательно, не будет обнаруживаться. Однако долгое время после трансфицирования людей с мутированными вставками может наблюдаться повышенная заболеваемость, которая может показаться вызванной наследственными факторами. Если трансфекция с инкорпорированием в геном хозяина имеет тенденцию внедрять вставку в конкретное место человеческого генома с высокой частотой и во многие клетки, и если эта вставка разрушает специфический ген, то могут наблюдаться побочные эффекты.

Потенциальное различие между обычным биологическим и геномным оружием может проявиться в клинических проявлениях заболеваний (42). Реальные симптомы, обнаруживаемые людьми, подвергшимися нападению, будут зависеть от трансгенов, которые внедряются в клетки, и от действия продуктов, за выработку которых ответственны эти гены, на функционирование клеток. Может играть роль и способ экспонирования или внедрения, определяющий механизм воздействия на ткани и симптоматику их поражения. В результате симптомы не могут быть схожими с какой-либо известной инфекционной болезнью. Представляется, что при воздействии этого типа биологического оружия заболеваемость и смертность будут зависеть от многих факторов, включая особенности использованных трансгенов и восприимчивость индивидов.

Следует иметь в виду еще один важный аспект этого типа оружия. Если главная цель геномной войны – вызвать заболевание у людей, то существует и вторичная задача – терроризирование тех, кто не подвергся трансфицированию. Перспектива применения оружия, которое может быть внедрено в геном человека, и перспектива трансфицирования таким оружием, которое долгие годы может не проявлять себя в преддверии планируемого нападения, неизбежно вызовет серьезное беспокойство у огромных групп людей.

Рекомендуемые превентивные действия

Предотвращение незаконного использования геномных проектов и программ по генной терапии в военных целях, вероятно, невозможно. Такое заключение основывается на длительной истории человечества использующего фактически каждый вид оружия во вред противнику. Кроме того, по мере прогресса в биотехнологии будут и дальше становиться доступными все более эффективные векторы для генной терапии. В мире широко распространяются технологии, необходимые для субклонирования генов. С результатами финансируемых общественными организациями геномных исследований можно знакомиться через интернет. Все эти факты в своей комбинации настоятельно требуют принятия защитных мер.

Эти меры, направленные против риска появления геномного оружия и опасности геномной войны, могут быть самыми разными, но в целом в них можно выделить два аспекта: политический и технический. Среди этих мер необходимыми являются продолжение и корректировка образовательных программ, предназначенных для информирования политиков и военного руководства о существующей опасности.

1. Пространные сведения о химическом и биологическом оружии и свидетельские показания об угрозе биотерроризма представлены в докладе Zilinskas (43) Подкомитету по национальной безопасности, по делам ветеринаров и международным отношениям Комитета по правительственной реформе Палаты представителей США. Геномика как быстро развивающаяся и прогрессирующая область научных исследований – сфера сугубо техническая. Обычные государственные и военные чиновники, так же как и лица, избираемые на свою должность, как правило, не представляют сложности этой технологии без соответствующего обучения. Даже сотрудники основных медицинских центров часто с трудом разбираются в сути геномной революции. Поэтому правительству следует рекомендовать, чтобы оно изыскало средства на создание понятных для политиков и непрерывно обновляющихся обучающих пособий по этой проблеме. Кроме того, должна быть образована президентская комиссия, занимающаяся не только оценкой риска геномного оружия, но и анализом всей государственной политики США, от которой зависит степень этого риска.

2. Далее, рекомендуется разработка исчерпывающих и постоянно совершенствуемых баз данных по истории, последовательностям и физическим характеристикам всех векторов, используемых в экспериментах по трансфицированию и генной терапии. Поскольку применить геномное оружие можно не только против людей, но и против сельского хозяйства, предстоит огромная работа. Это оружие, по-видимому, должно разрабатываться на основе имеющихся ресурсов. Зачастую они существуют на общедоступном рынке, но иногда в отношении их действуют права частной собственности. Несмотря на спорность этого вопроса и большое нежелание биотехнологических компаний, для предотвращения существующей угрозы представляется обоснованным раскрытие данных о векторных последовательностях. Когда такие данные становятся общедоступными, можно разрабатывать и методы обнаружения векторов. Например, можно создавать наборы олигонуклеотидных праймеров, которые позволят определять уникальные характеристики этих векторов на основе методик с использованием полимеразной цепной реакции и/или микрочипов. Рекомендуется также раскрывать данные о генах и последовательностях, потенциально имеющих военное значение, путем постоянного отслеживания и составления каталогов многих геномных проектов с учетом возможных последствий применения этих последовательностей в боевых геномных агентах. Цель этой большой работы состоит в создании базы данных, которая позволит нам предвидеть, против каких мишеней разрабатываются те или иные геномные агенты.

3. Необходимо ускорить идущие в настоящее время исследования и разработки пригодных для полевых условий, практичных и точных систем обнаружения генов и векторов, в том числе таких, для которых возможно военное применение. С момента терактов с использованием сибирской язвы осенью 2001 г. в этом направлении уже проделана большая работа. Однако еще больше нужно сделать, чтобы такие приборы стали общедоступными. Они должны быть предназначены не только для обнаружения обычных биоагентов, но и применяться для выявления самых разных векторов при помощи методов, основанных на полимеразной цепной реакции или на микрочипах. При обнаружении возбудителя сибирской язвы, применяемого в виде аэрозоля, достаточно хорошую чувствительность обеспечивает непрерывный отбор проб в районе важных с точки зрения противника целей (44), но этот подход может быть в равной степени полезен и при обнаружении боевых геномных агентов.

4. Наконец, нужны исследования по организации работ по устранению последствий нападения с применением этого оружия, если оно уже произошло. Такие исследования должны быть весьма разносторонними и обеспечивать возможность оценки не только физического, но и психологического воздействия этого вида оружия на население. Что касается физического воздействия, то иммунизация может быть не только неэффективной, но даже и ненужной, поскольку, будучи направленной против вирусных векторов, используемых в легитимной генной терапии, она сделает их неэффективными и в случае, когда они могут пригодиться в терапевтических целях. Даже когда эта технология может применяться для изготовления оружия, она может быть полезной и как средство противодействия военизированным векторам. Поэтому желательно приступить к исследованиям, позволяющим установить, каким образом можно нейтрализовать вредное для здоровья воздействие боевых геномных агентов без потери возможности использования этой же технологии для лечения больных, которые нуждаются в генной терапии.

Заключение

Данная статья представляет собой обзор причастности генномных проектов и генной терапии к разработке будущего биологического оружия. Она может служить основой для получения представления о геномных проектах, генной терапии и используемых в ней векторах и охватывает возможные характеристики и эпидемиологические особенности применения геномного оружия. Наконец, в ней обсуждаются рекомендуемые меры защиты и противодействия созданию этого оружия.

Хотя в определенной мере это обсуждение является умозрительным, изложенное в ней подтверждается другой публикацией, в которой описывается синтез жизнеспособного и инфекционного мышиного полиовируса (45). Геномная революция напоминает историю с расщеплением атома, в которой участвовал другой “джин из бутылки”. Так же, как расщепление атома, геномная революция может быть использована для создания оружия. Вполне очевидно, что необходим план действий, чтобы воспрепятствовать злонамеренному использованию этих многообещающих исследований в данной области знаний.

Интернет-журнал "Коммерческая биотехнология" http://www.cbio.ru/

Список литературы :

1. Fraser CM, Danclo MR: Genomics and future biological weapons: the need for preventive action by the biomedical community. Nat Genet 2001; 29: 253-6.

2. Anonymous: Gene warfare-unless we keep our guard up. Lancet 1996; 348: 1183.

3. International Human Genome Sequencing Consortium: Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 2001; 409: 860-921.

4. Venter JC, Adams MD, Myers EW, et al: The sequence of the human genome. Science 2001; 291: 1304-51.

5. Drews J: Research and development: basic science and pharmaceutical innovation. Nat Biotechnol 1999; 17: 406.

6. Drews J: Drug discovery: a historical perspective. Science 2000; 287: 1960-4.

7. Fleischmann RD, Adams MD, White O, et al: Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd. Science 1995; 269: 496-512.

8. Fraser CM, Gocayne JD, White O, et al: The minimal gene complement of Mycoplasma genitalium. Science 1995; 270: 397-403.

9. Cherry JM, Ball C, Weng S, et al: Genetic and physical maps of Saccharomyces cerevisiae. Nature 1997; 387: 67-73.

10. Bult CJ, White O, Olsen GJ, et al: Complete genome sequence of the methanogenic archaeon, Methanococcus jannaschii. Science 1996; 273: 1058-73.

11. Blattner FR, Plunkett G 3rd, Bloch CA, et al: The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science 1997; 277: 1453-74.

12. Cole ST, Brosch R, Parkhill J, et al: Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence. Nature 1998; 393: 537-44.

13. The Caenorhabditis elegans Sequencing Consortium: Genomic sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science 1998; 282: 2012-8.

14. Adams MD, Celniker SE, Holt RA, et al: The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science 2000; 287: 2185-95.

15. Parkhill J, Wren BW, Thomson NR, et al: Genome sequence of Yersinia pestis, the causative agent of plague. Nature 2001; 413: 523-7.

16. Russell SJ: Science, medicine, and the future: gene therapy. Br Med J 1997; 315: 1289-92.

17. Zlokovic BV, Apuzzo MLJ: Cellular and molecular neurosurgery: pathways from concept to reality. Part II: Vector systems and delivery methodologies for gene therapy of the central nervous system. Neurosurgery 1997; 40: 805-13.

18. Gojo S, Cooper DKC, Iacomini J, LeGuern C: Gene therapy and transplantation. Transplantation 2000; 69: 1995-9.

19. Kouraklis G: Gene therapy for cancer: from the laboratory to the patient. Dig Dis Sci 2000; 45: 1045-52.

20. Springer CJ, Niculescu-Duvaz I: Prodrug-activating systems in suicide gene therapy. J Clin Invest 2000; 105: 1161-7.

21. Bestor TH: Gene silencing as a threat to the success of gene therapy. J Clin Invest 2000; 105:409-11.

22. Smaglik P: Gene therapy institute denies that errors led to trial death. Nature 2000; 403: 820.

23. Zlokovic BV, Apuzzo MLJ: Cellular and molecular neurosurgery: pathways from concept to reality. Part I: Target disorders and concept approaches to gene therapy of the central nervous system. Neurosurgery 1997; 40: 789-804.

24. Sapolsky RM, Steinberg GK: Gene therapy using viral vectors for acute neurologic insults. Neurology 1999; 53: 1922-31.

25. Kroshus TJ, Bolman RM, Dalmasso AP, et al: Expression of human CD59 in transgenic pig organs enhances organ survival in an ex vivo xenogeneic perfusion model. Transplantation 1996; 61: 1513-21.

26. Coffin JM: Retroviridae and their replication. In Virology. Edited by Fields BN. New York, Raven Press Ltd, 1990.

27. Watson JD, Hopkins NH, Robert JW, Steitz JA, Weiner AM: Molecular Biology of the Gene, Ed 4. New York, Benjamin-Cummings, 1988.

28. Suhr ST, Gage FH: Gene therapy in the central nervous system: the use of recombinant retroviruses. Arch Neurol 1999; 56: 287-92.

29. Herrmann F: Cancer gene therapy: principles problems and perspectives. J Mol Med 1995; 73: 157-63.

30. Gelinas C, Temin HM: Non-defective spleen necrosis virus-derived vectors define the upper size limit for packaging reticuloendotheliosis viruses. Proc Natl Acad Sci USA 1986; 83: 9211-5.

31. Miller AD: Retrovirus packaging cells. Hum Gene Ther 1990; 1: 5-14.

32. Hermiston T: Gene delivery from replication-selective viruses: arming guided missiles in the war against cancer. J Clin Invest 2000; 105: 1169-72.

33. Zhu N, Liggitt D, Liu Y, Debs R: Systemic gene expression after intravenous DNA delivery into adult mice. Science 1993; 261: 209-11.

34. Agha-Mohammadi S, Lotze MT: Regulatable systems: applications in gene therapy and replicating viruses. J Clin Invest 2000; 105: 1177-83.

35. Gossen M, Freundlieb S, Bender G, Muller G, Hillen W, Bujard H: Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science 1995; 268: 1766-89.

36. Wang Y, DeMayo FJ, Tsai SY, O'Malley BW: Ligand-inducible and liver-specific target gene expression in transgenic mice. Nat Biotechnol 1996; 15: 239-43.

37. No D, Yao T-P, Evans RM: Ecdysone-inducible gene expression in mammalian cells and transgenic mice. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 3346-51.

38. Rivera VM, Clackson T, Natesan S, et al: A humanized system for pharmacologic control of gene expression. Nat Med 1996; 2: 1028-32.

39. Kennedy BN, Vihtelic T, Checkley L, Vaughan KT, Hyde DR: Isolation of a zebra fish rhodopsin promoter to generate a transgenic zebra fish line expressing enhanced green fluorescent protein in rod photoreceptors. J Biol Chem 2001; 276: 14037-43.

40. Kurtz TW, Gardner DG: Transcription-modifying drugs: a new frontier in the treatment of the central hypertension. Hypertension 1998; 32: 380-6.

41. Ashburner M, Ball CA, Blake JA, et al: Gene ontology: tool for the unification of biology: The Gene Ontology Consortium. Nat Genet 2000; 25: 25-9.

42. Noah DL, Sobel AL, Ostroff SM, Kildew JA: Biological warfare training: infectious disease outbreak differentiation criteria. Milit Med 1998; 163: 198-201.

43. Zilinskas RA: Report to U.S. House of Representatives Committee on Governmental Reform, Subcommittee on National Security, Veterans Affairs, and International Relations. Combating Terrorism: Assessing the Threat of BioTerrorism. October 20, 1999.

44. Makin S-I, Cheun HI, Watarai M, Uchida I, Takeshi K: Detection of anthrax spores from the air by real-time PCR. Lett Appl Microbiol 2001; 33: 237-40.

45. Cello J, Paul AV, Wimmer E: Chemical synthesis of poliovirus cDNA: generation of infectious virus in the absence of natural template. Science 2002; 297: 1016-8.

<< на главную
<< назад